Was ist Zellkultur?
Zellkultur
Zellkultur bezieht sich auf den Prozess des Wachstums von Zellen unter kontrollierten Bedingungen außerhalb ihrer natürlichen Umgebung. Es ist ein In-vitro-Tool, das das Verständnis der Zellbiologie und der Krankheitsmechanismen erleichtert. Es spielt auch eine Rolle bei der Arzneimittelforschung, wie z. B. Arzneimitteltoxizitätstests und pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Studien sowie in der personalisierten Medizin.
Der amerikanische Embryologe Ross Granville Harrison entwickelte im frühen 20. Jahrhundert die ersten In-vitro-Zellkulturtechniken, als er erfolgreich Gewebefragmente aus Froschembryos in vitro züchtete. Heute hat die Zellkultur zu unzähligen Entdeckungen beigetragen, beispielsweise zur Entwicklung von Impfstoffen gegen Polio, Masern, Mumps und andere Infektionskrankheiten.
Adhäsions- und Suspensionskultur
Es gibt zwei Grundsysteme für das Zellwachstum: adhärente Kultur und Suspensionskultur. Adhärente Kulturen werden auf künstlichen Substraten gezüchtet, während Zellen in Suspensionskulturen frei im Medium schwimmen. Während nur wenige Zelltypen in Suspension natürlich wachsen (z. B. Lymphozyten), können viele adhärente Zelltypen an die Suspensionskultur angepasst werden.
Es gibt zwei Gründe für die Kultivierung natürlich anhaftender Zellen in Suspension. Der erste Vorteil der Suspensionskultur besteht darin, dass die Zellen leichter passierbar sind, da sie nicht enzymatisch oder mechanisch vom Kulturgefäß getrennt werden müssen. Zweitens lassen sich Suspensionskulturen leichter maßstäblich vergrößern, da das Zellwachstum nur durch ihre Konzentration im Medium und nicht durch die verfügbare Oberfläche begrenzt ist. Der Hauptnachteil von Suspensionskulturen besteht darin, dass sie tägliche Zellzählungen und Lebensfähigkeitstests erfordern, um Wachstumsmustern zu folgen, während adhärente Kulturen leicht unter einem Mikroskop untersucht werden können.
2D- und 3D-Verfahren
Adhärente Kulturen können weiter in 2D- und 3D-Kulturen unterteilt werden. Bei 2D-Anwendungen werden adhärente Zellen in einem Monolayer-System auf einer ebenen Oberfläche gezüchtet, beispielsweise in einer Zellkulturflasche.
Zellkultur
Aufgrund ihrer Einfachheit kann die 2D-Technologie die In-vivo-Umgebung von Zellen nicht nachahmen, die typischerweise in dreidimensionalen Strukturen mit komplexen Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen wachsen. Aus diesem Grund werden einige Experimente mit 3D-Kulturen durchgeführt, die mit gerüstbasierten oder gerüstfreien Technologien gezüchtet werden können.
Gerüstbasierte 3D-Methoden beinhalten typischerweise das Züchten adhärenter Zellen in Hydrogelgerüsten. Für einige Anwendungen werden auch Alternativen wie Biokeramik-, Metall- oder Polymergerüste verwendet.
Gerüstfreie Techniken werden verwendet, um Sphäroide mit einer von drei verschiedenen Methoden zu züchten:
Forced Float: Laden Sie die Zellsuspension in die Vertiefungen einer polymerbeschichteten Mikroplatte mit geringer Haftung. Die Mikroplatte wird dann zentrifugiert, um die Zellen dazu zu zwingen, Sphäroide zu bilden.
Hängender Tropfen: Die Zellsuspension wird in die Vertiefungen einer hängenden Tropfenplatte geladen. Wie der Name schon sagt, hängt die Suspension in Form von Tropfen auf dem Teller. Zellen aggregieren an den Spitzen dieser Tröpfchen und bilden Kugeln.
Rührbasiert: Die Zellsuspension wird in einen rotierenden Bioreaktor gegeben. Aufgrund der ständigen Bewegung konnten die Zellen nicht an den Wänden haften und bildeten so Sphäroide.
Zellkultur-Challenge
Trotz der Unterschiede in Methoden und Techniken haben alle Experimente eines gemeinsam: Es ist schwierig, lebende Zellen in der erforderlichen Anzahl zu züchten, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Daher widmen sich die folgenden Abschnitte vier Herausforderungen – Wiederholbarkeit, Kontamination, Machbarkeit und dem Übergang zur Automatisierung.
Reproduzierbarkeit
Laut einer Umfrage von Yongyue Medical gaben mehr als 70 Prozent der Wissenschaftler an, dass sie die Experimente eines anderen Wissenschaftlers nicht reproduzieren konnten, und mehr als die Hälfte versäumte es, ihre eigene Arbeit zu reproduzieren. Bei Zellkulturassays entstehen die meisten Reproduzierbarkeitsprobleme aus biologischen Unterschieden zwischen Zellpassagen oder Generationen. Ein weiteres großes Problem ist die falsche Identifizierung von Zelllinien, und auch Inkonsistenzen in den Kulturparametern spielen eine wichtige Rolle.
biologische Variation
Faktoren wie zufällige Mutationen oder Transkriptionsfehler können die Reproduzierbarkeit von Experimenten bei jeder Zellteilung beeinträchtigen. Um dies zu vermeiden, sollten Sie zu Beginn eines neuen Projekts eine Zellbank anlegen.
Zellbank
Cell Banking bezieht sich auf den Prozess der Aufbewahrung von Chargen bestimmter Zelltypen für die spätere Verwendung, um Faktoren wie zufällige Mutationen oder Transkriptionsfehler zu vermeiden, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen. Der erste Schritt besteht darin, eine Master-Zellbank (MBC) einzurichten, indem ausgewählte Zelltypen von Interesse in Kultur gezüchtet und in mehreren Behältern kryokonserviert werden. MBC-Batches werden aufgetaut und später verwendet, um Working Cell Banks (WBCs) vorzubereiten.
Fehlidentifikation von Zelllinien
Das Problem der falschen Identifizierung von Zelllinien ist seit den 1960er Jahren bekannt, als ein Wissenschaftler die Kontamination von 19 anderen menschlichen Zelllinien mit HeLa-Zellen beschrieb. Um sicherzustellen, dass Ihre Ergebnisse zuverlässig sind und Sie vor allem keine falschen Schlüsse ziehen, sollten Sie alle neuen Zelllinien, die ins Labor gelangen, unter Quarantäne stellen, bis ihre Herkunft überprüft wurde. Am wichtigsten ist, dass empfohlen wird, die Zelllinienqualifizierung vor der Kryokonservierung und Verteilung an andere Labore und nach Abschluss des Projekts zu wiederholen. Um eine Zelllinie zu verifizieren, sollten Sie zuerst prüfen, ob sie im Register für falsch identifizierte Zelllinien aufgeführt ist. Wenn es nicht registriert ist, müssen Sie noch seine Echtheit bestätigen. Für menschliche Zelllinien wird die Short Tandem Repeat (STR)-Analyse (DNA-Fingerprinting) empfohlen. Für nicht-menschliche Zelllinien stehen verschiedene Testmethoden zur Verfügung, darunter Karyotypisierung, Isoenzymanalyse und mitochondriale DNA-Typisierung (DNA-Barcoding).
Kulturparameter
Ein dritter Faktor, der die Reproduzierbarkeit beeinflusst, sind Kulturparameter.
Beispielsweise können Sauerstoffwerte kultivierte Zellen erheblich beeinflussen. Variablen, die die Oxygenierung beeinflussen, wie Kammergröße oder Zelldichte, werden jedoch nicht immer dokumentiert und können daher nicht konsistent gehalten werden.
Ein weiterer wichtiger Kulturparameter ist das Medium. Dies liefert essentielle Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Hormone und reguliert den pH-Wert und den osmotischen Druck. Daher ist das Wichtigste, dass seine Zusammensetzung immer gleich ist. Dies ist besonders kritisch für mit fötalem Rinderserum (FBS) ergänzte mittlere Formulierungen, deren Zusammensetzung von Faktoren wie der Ernährung der Kuh, dem geografischen Standort und der Jahreszeit abhängt. Um die Auswirkung von FBS auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu minimieren, sollten Sie verschiedene Serumchargen bestellen, wenn die aktuellen Bestände zur Neige gehen, und sie testen, um die beste Übereinstimmung zu finden. Damit andere Ihre Ergebnisse reproduzieren können, sollten Sie berichten, wie Sie das Serum gescreent haben, und die Chargennummer notieren.
Zellkultur
Zellverarbeitung
Die meisten Forscher wissen, dass Kulturparameter einen großen Einfluss auf ihre Anwendungen haben, aber Änderungen in den Verarbeitungstechniken werden oft übersehen.
Verschmutzung
Wenn Zellen aus Gewebe isoliert und im Labor gezüchtet werden, sind sie nicht mehr durch das Immunsystem geschützt und daher extrem anfällig für Kontaminationen.
Die erste Kontaminationsquelle sind abiotische Kontaminanten wie Verunreinigungen in Kulturmedium, Serum, Nahrungsergänzungsmitteln oder Wasser sowie Endotoxine und auslaugbare Stoffe. Zu den Vorsichtsmaßnahmen gehören die Verwendung von Wasser in Laborqualität für Zellkulturexperimente sowie Medien, Serum, Nahrungsergänzungsmittel und Verbrauchsmaterialien von Herstellern, die eine Zertifizierung für Endotoxintests anbieten. Darüber hinaus müssen Verbrauchsmaterialien aus reinem Polystyrol oder Polypropylen hergestellt sein, um sicherzustellen, dass keine Kunststoffzusätze in Ihre Zellkultur eindringen.
Die zweite Kontaminationsquelle sind biologische Verunreinigungen wie Bakterien (einschließlich Mykoplasmen), Pilze und Hefen.
Durchführbarkeit
Die Zelllebensfähigkeit ist definiert als der Anteil lebensfähiger Zellen in einer Probe. Zusätzlich zu den Verunreinigungen, die wir gerade gesehen haben, gibt es verschiedene andere Faktoren, die die Lebensfähigkeit von Zellen beeinflussen. Umgebungsbedingungen – Temperatur, pH-Wert, osmotischer Druck, Nährstoffverfügbarkeit sowie O2- und CO2-Konzentrationen – sind sehr wichtig. Die meisten dieser Variablen werden durch das Medium gesteuert und sind zelltypspezifisch, was leider bedeutet, dass wir keine spezifischen Richtlinien geben können.
Da Zellen sehr druckempfindlich sind, sollten Sie nicht nur auf die Umgebungsbedingungen achten, sondern auch auf Ihre Liquid-Handling-Techniken.
Ein letzter Faktor, der die Zelllebensfähigkeit beeinflusst, ist die Seneszenz. Die meisten endlichen Zelllinien überleben 20 bis 60 Teilungen, bevor sie sterben, was bedeutet, dass sie nur zwischen 15 und 45 Generationen wiederverwendet werden können. Anschließend muss die kryokonservierte Probe aus der Zellbank aufgetaut werden. Kontinuierliche Zelllinien können sich unbegrenzt vermehren, aber da sie anfällig für genetische Drift sind, sollten sie regelmäßig ersetzt werden.
Nachweisassays unter Verwendung von kolorimetrischen, fluorometrischen und biolumineszenten Verfahren können verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit zu messen. Eine häufig verwendete kolorimetrische Methode ist die MTT-Methode, die auf der Reduktion von gelben Tetrazoliumsalzen zu violetten Formazankristallen durch lebende Zellen basiert.
96-Wellplatten
Automatisierung
Viele der oben beschriebenen Herausforderungen können durch die Automatisierung von Zellkultur-Workflows angegangen werden. Beispielsweise wird die Zellhandhabung immer konsistent sein, was sich positiv auf die Reproduzierbarkeit und Lebensfähigkeit auswirkt. Am wichtigsten ist, dass die Automatisierung das Risiko einer Benutzerkontamination verringert.
Trotz dieser Vorteile kann die Automatisierung ganzer Arbeitsabläufe aus Budgetgründen, Platzmangel für Roboter oder weil nicht genügend Ressourcen vorhanden sind, um jeden Schritt auf einmal zu automatisieren und zu validieren, eine Herausforderung darstellen. Aber das lässt sich lösen!