Die PCR-Technologie ähnelt dem natürlichen Replikationsprozess von DNA, und ihre Spezifität beruht auf Oligonukleotid-Primern, die zu beiden Enden der Zielsequenz komplementär sind. Die PCR besteht aus drei grundlegenden Reaktionsschritten: Denaturierung, Annealing und Extension. Dieser Reaktionsvorgang wird im PCR-Reaktionsbehälter durchgeführt. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung des Genamplifikationsinstruments hat auch der Reaktionsbehälter die schrittweise Entwicklung des Zentrifugenröhrchens von 1,5 ml über 0,2 ml (0,25 ml) zum dünnwandigen {{ 7}}.2 ml für PCR. , 0.1mlPCR-Röhrchen. Mit der Zunahme der Anzahl von PCR-Amplifikationsreaktionen werden nach und nach Hochdurchsatz-Genamplifikationsbehälter für PCR-Streifen und PCR-Platten gebildet.
Die PCR besteht aus drei grundlegenden Reaktionsschritten: Denaturierung-Annealing-Extension
Denaturierung der Template-DNA:
Nachdem die Matrizen-DNA für einen bestimmten Zeitraum auf etwa 94 Grad erhitzt wurde, wird die doppelsträngige DNA der Matrizen-DNA oder die durch PCR-Amplifikation gebildete doppelsträngige DNA dissoziiert, so dass sie mit dem zu präparierenden Primer kombiniert werden kann für die nächste Reaktionsrunde.
Annealing (Renaturierung) von Template-DNA mit Primern:
Nachdem die Matrizen-DNA durch Erhitzen zu einem Einzelstrang denaturiert und die Temperatur auf etwa 55 Grad gesenkt wurde, werden die Primer mit der komplementären Sequenz des Einzelstrangs der Matrizen-DNA gepaart.
Verlängerung von Primern:
Unter der Wirkung von Taq verwendet das DNA-Matrizen-Primer-Konjugat dNTP als Reaktionsrohstoff, um eine neue halbreservierte Replikationskette zu synthetisieren, die komplementär zur Matrizen-DNA-Kette gemäß dem Prinzip der Basenpaarung und halbreservierten Replikation ist.
Grundprinzipien der PCR-Technologie
Die Technologie beruht auf einer enzymatischen Synthesereaktion der DNA-Polymerase in Gegenwart von Matrizen-DNA, Primern und vier Desoxyribonukleotiden.
DNA-Polymerase verwendet einzelsträngige DNA als Matrize, um die Synthese mit einem kleinen Stück doppelsträngiger DNA zu initiieren. Ein oder zwei synthetische Oligonukleotid-Primer werden mit einer komplementären Sequenz in der einzelsträngigen DNA-Matrize kombiniert, um eine teilweise doppelsträngige DNA zu bilden.
Unter einer geeigneten Temperatur und Umgebung fügt die DNA-Polymerase Desoxymononukleotid an das 3´-OH-Ende des Primers an und verwendet dieses als Ausgangspunkt, um sich entlang der 5´→3´-Richtung der Matrize zu verlängern, um einen neuen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren .
Der Unterschied zwischen PCR-Röhrchen und Zentrifugenröhrchen
PCR-Röhrchen:
Die PCR-Reaktionsplatte ist 96-Well oder 384-Well, die speziell für Batch-Reaktionen entwickelt wurde. Das Prinzip ist, dass der Durchsatz der PCR-Maschine und des Sequenzers im Allgemeinen 96 oder 384 beträgt.
Zentrifugenröhrchen:
Das Zentrifugenröhrchen ist nicht unbedingt ein PCR-Röhrchen. Es gibt viele Arten von Zentrifugenröhrchen entsprechend ihrer Kapazität. Die am häufigsten verwendeten sind 1,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 oder 50 ml, und das kleinste (250 ul) kann als PCR-Röhrchen verwendet werden.
So wählen Sie PCR-Röhrchen aus
Wir entschieden uns für die Platzierung der PCR-Röhrchen in der Hoffnung, den genauesten Ort für die Temperatur zu wählen.
Die genaueste Position der Temperatur sollte die Position über dem Temperatursensor unter dem Modul sein (unabhängig von der ungenauen Temperatur des Sensors).
Die Position des Temperatursensors verschiedener PCR-Instrumente ist unterschiedlich.
Zum Beispiel hat der 2720 von AB nur einen in der Mitte, der 200 von MJ hat drei Sensoren, die unten links, in der Mitte und oben rechts sind, der von Eppendorf sollte in Reihe A oder H sein, und der Dongshenglong 811 hat drei Temperatursensoren, B{{3} } gewählt werden, C1-2, C6-7, D6-7, B11-12, C11-12, da diese Punkte Temperaturpunktpunkte sind.
