Die Zellkultur ist eines der wichtigsten Werkzeuge, die in der Zell- und Molekularbiologie verwendet werden, und bietet ein hervorragendes Modellsystem zum Studium der normalen Physiologie und Biochemie (z. B. Stoffwechselstudien, Alterung), der Auswirkungen von Arzneimitteln und toxischen Verbindungen auf Zellen sowie der Auswirkungen der Zellmutagenese und Karzinogenese. Es wird auch beim Screening und der Entwicklung von Arzneimitteln sowie bei der großtechnischen Produktion biologischer Verbindungen (z. B. Impfstoffe, therapeutische Proteine) verwendet. Ein großer Vorteil der Verwendung von Zellkulturen für alle diese Anwendungen ist die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, die durch die Verwendung einer Charge klonaler Zellen erzielt werden können.
Zellkultur
Zellkultur bezieht sich auf die Entnahme von Zellen aus Tieren oder Pflanzen und ihr Wachstum in einer günstigen künstlichen Umgebung. Zellen können direkt aus dem Gewebe entfernt und vor der Kultivierung enzymatisch oder mechanisch dissoziiert werden, oder sie können von etablierten Zelllinien oder -stämmen stammen
1. Grundausbildung
Primärkultur bezieht sich auf das Stadium der Kultur, nachdem Zellen aus Gewebe isoliert und unter geeigneten Bedingungen vermehrt wurden, bis sie das gesamte verfügbare Substrat einnehmen (dh Konfluenz erreichen). In diesem Stadium müssen die Zellen subkultiviert (dh passagiert) werden, indem sie in einen neuen Behälter mit frischem Wachstumsmedium überführt werden, um mehr Platz für weiteres Wachstum zu schaffen.
2. Zelllinien
Nach der ersten Subkultur werden Primärkulturen als Zelllinien oder Subklone bezeichnet. Von Primärkulturen abgeleitete Zelllinien haben eine endliche Lebensdauer (dh sie sind endlich) und wenn sie passagiert werden, überwiegen Zellen mit dem höchsten Wachstumspotential, was zu einem gewissen Grad an genotypischer und phänotypischer Einheitlichkeit im Populationsgeschlecht führt.
3. Zelllinien
Eine Zelllinie wird zu einem Zellstamm, wenn eine Subpopulation der Zelllinie durch Klonen oder andere Verfahren aktiv aus der Kultur selektiert wird. Zelllinien erwerben häufig zusätzliche genetische Veränderungen, nachdem die Elternlinie initiiert wurde.
4. Begrenzte Zelllinien und kontinuierliche Zelllinien
Normale Zellen teilen sich normalerweise nur eine begrenzte Anzahl von Malen, bevor sie ihre Fähigkeit zur Proliferation verlieren, ein genetisch bedingtes Ereignis, das als Seneszenz bezeichnet wird. diese Zelllinien werden endlich genannt. Einige Zelllinien werden jedoch durch einen als Transformation bezeichneten Prozess unsterblich, der spontan erfolgen oder chemisch oder viral induziert werden kann. Eine endliche Zelllinie wird zu einer kontinuierlichen Zelllinie, wenn sie eine Transformation durchläuft und die Fähigkeit zur unbegrenzten Teilung erwirbt.
Kontinuierlich kultivierte Zelllinien sind anfällig für genetische Drift, endliche Zelllinien sind zum Altern verurteilt, alle Zellkulturen sind anfällig für mikrobielle Kontamination, und selbst in den am besten geführten Labors kann es zu Geräteausfällen kommen. Da etablierte Zelllinien eine wertvolle Ressource sind, deren Ersatz kostspielig und zeitaufwändig ist, ist ihre Kryokonservierung für die Langzeitlagerung unerlässlich.
Sobald eine kleine Anzahl verbleibender Zellen aus der Subkultur gewonnen wurde, sollten sie als Saatgut eingefroren und vor der allgemeinen Verwendung im Labor geschützt werden. Arbeitsvorräte können aus gefrorenen Saatgutvorräten hergestellt und ergänzt werden. Wenn der Saatvorrat erschöpft ist, kann der kryokonservierte Arbeitsvorrat als Quelle für die Herstellung von frischem Saatvorrat verwendet werden, was zu einer minimalen Mengensteigerung gegenüber dem anfänglichen Einfrieren führt.
Der beste Weg, kultivierte Zellen zu kryokonservieren, ist in flüssigem Stickstoff, in vollständigem Medium, in Gegenwart von Kryoschutzmitteln wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerol. Kryoprotektiva senken den Gefrierpunkt des Mediums und reduzieren auch die Abkühlgeschwindigkeit, wodurch das Risiko der Bildung von Eiskristallen, die Zellen schädigen und zum Zelltod führen können, stark reduziert wird.
Von DMSO ist bekannt, dass es den Eintritt organischer Moleküle in Gewebe erleichtert. Beim Umgang mit Reagenzien, die Dimethylsulfoxid enthalten, sollten Geräte und Verfahren verwendet werden, die für die Gefahren dieses Materials geeignet sind. Reagenzien gemäß den örtlichen Vorschriften entsorgen.
Züchten Sie Zellen aus gefrorenen Arbeitszellvorräten
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Bestimmen Sie die Anzahl der Passagen, z. B. wenn die vorherigen Zellen eingefroren waren und dreimal aufgetaut wurden, wäre der Auftauvorgang die vierte Passage.
Fügen Sie Wachstumsmedien (Minimalmedien, Kälberserum und Antibiotika) zu T75-Flaschen hinzu, die mit Zelllinie, Passagennummer und Datum gekennzeichnet sind
Legen Sie den Kolben horizontal in einen CO-Inkubator bei 37 Grad und 5 Prozent CO für mindestens 15 min. Dadurch wird das Medium erwärmt und auf seinen normalen pH-Wert (7,0-7,6) gebracht.
Tauen Sie gefrorene Fläschchen mit Zelllinien in einem 37-Grad-Wasserbad unter leichtem Rühren auf. Um das Kontaminationsrisiko zu verringern, halten Sie den O-Ring und die Kappe über dem Wasserspiegel (2-5 Minuten).
Stellen Sie das Fläschchen in eine biologische Sicherheitswerkbank (BSL-2). Um eine Kontamination zu vermeiden, vor dem Öffnen des Fläschchens mit 70-prozentigem Ethanol abwischen.
Übertragen Sie den Inhalt des gefrorenen Zellkolbens in einen T75-Kolben mit Wachstumsmedium. Mischen und schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig über die Oberfläche des Kolbens zu verteilen.
Inkubieren Sie den Kolben über Nacht in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad mit 5 Prozent CO2. Lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften
sich veränderndes Wachstumsmedium
Inkubieren Sie die Flasche für weitere 2-4 Tage bei 37 Grad, 5 % CO2 und beobachten Sie, bis die Zellen wachsen
Sobald die Zellen etwa 90 Prozent Konfluenz erreichen, kann der Zellbestand mit einem T150-Kolben erweitert werden
