Wenn Sie gerade Ihren Abschluss gemacht haben und in den Job eingetreten sind, stehen Sie vor einer Reihe von Substantiven, die quantitativen Echtzeit-PCR-Experimenten gegenüberstehen. Sind Sie verwirrt darüber, wo Sie anfangen sollen? Was bedeuten Amplifikationskurve, Standardkurve, Schwelle, CT-Wert, Schmelzkurve und Basislinie? Die fluoreszierenden Bilder dieser Experimente sind zu hell, aber ich kann sie nicht identifizieren. Heute nehmen wir Sie mit, um diese Kenntnisse und Konzepte in zwei Teilen zu lernen: Fachbegriffe und häufig gestellte Fragen.
Teil I Geschäftsbedingungen
1. Verstärkungskurve
Die Amplifikationskurve bezieht sich auf die Kurve, bei der die Zykluszahl die Abszisse und die Echtzeit-Fluoreszenzintensität während der Reaktion die Ordinate während der PCR ist.
2. Grundlinie
Die Basislinie bezieht sich auf eine geringe Änderung des Fluoreszenzsignals während der ersten paar Zyklen einer PCR-Amplifikationsreaktion. Der Signalpegel zeigt nahezu eine gerade Linie, die die Grundlinie darstellt.
3. Einstellung der Fluoreszenzschwelle
Typischerweise wird das Fluoreszenzsignal der ersten 15 Zyklen der PCR-Reaktion als Fluoreszenzhintergrundsignal verwendet, und die Fluoreszenzschwelle ist das 10-fache der Standardabweichung des Fluoreszenzsignals während 3-15 PCR-Zyklen und der Fluoreszenzschwelle wird während der exponentiellen Phase der PCR-Amplifikation eingestellt. Typischerweise hat jedes Instrument vor der Verwendung seine Fluoreszenzschwelle.
4. CT-Wert
Der CT-Wert stellt die Anzahl der Zyklen dar, die für jedes PCR-Reaktionsröhrchen auftreten, wenn das Fluoreszenzsignal den eingestellten Schwellenwert erreicht. Aus der Forschung wissen wir, dass es eine lineare Beziehung zwischen dem CT-Wert jeder Vorlage und dem Logarithmus der Startkopienzahl dieser Vorlage gibt. Je höher die anfängliche Kopienzahl, desto kleiner der CT-Wert und umgekehrt. Unter Verwendung von Standards mit bekannten Startkopienzahlen kann eine Eichkurve erstellt werden, bei der die Abszisse den Logarithmus der Startkopienzahl darstellt, während die Ordinate den CT-Wert darstellt. Solange der CT-Wert der unbekannten Probe erhalten wird, kann daher die anfängliche Kopienzahl der Probe aus der Standardkurve berechnet werden.
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Es gibt mehrere Indikatoren, um zu beurteilen, ob die Verstärkungskurve gut ist oder nicht:
Antwort: Der Wendepunkt der Kurve ist offensichtlich, insbesondere die exponentielle Phase der Probe der schwach-schweren Fraktion ist offensichtlich, die Gesamtparallelität der Amplifikationskurve ist sehr gut, die Basislinie ist flach, es gibt kein ansteigendes Phänomen und die Amplifikation Kurve der exponentiellen Phasenkonzentrationsprobe auf niedrigem Niveau ist sehr gut. offensichtlich.
B: Die Steigung der exponentiellen Phase der Kurve ist direkt proportional zur Verstärkungseffizienz, je größer die Steigung, desto höher die Verstärkungseffizienz.
C: Die Standardbasislinie ist flach oder leicht rückläufig, ohne erkennbaren Aufwärtstrend.
D: Die Parallelität der Amplifikationskurven für jedes Röhrchen ist gut, was anzeigt, dass die Amplifikationseffizienz jedes Reaktionsröhrchens ähnlich ist.
5. Schmelzkurve
Wenn das PCR-Produkt erhitzt wird, dissoziiert das doppelsträngige Amplifikationsprodukt mit steigender Temperatur allmählich, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt. Bei Erreichen einer bestimmten Temperatur scheidet sich eine große Produktmenge ab, was zu einem starken Abfall der Fluoreszenz führt. Die Verwendung dieser Funktion zusammen mit unterschiedlichen TM-Werten für verschiedene PCR-Produkte unterscheidet sich auch in der Temperatur, bei der das Fluoreszenzsignal schnell abnimmt, was ein guter Weg sein kann, die PCR-Spezifität zu identifizieren.
6. Schmelzkurve (mit logarithmischer Kurve)
Das Peakdiagramm wird durch den Logarithmus der Schmelzkurve gebildet, um die Situation der Produktfragmente intuitiver anzuzeigen. Da die Schmelztemperatur der TM-Wert eines DNA-Fragments ist, können bestimmte Parameter bestimmt werden, die den TM-Wert eines DNA-Fragments beeinflussen, wie z dass die Länge des amplifizierten Produkts im Bereich von 80-300 bp liegt und die Schmelztemperatur zwischen 80 Grad und 90 Grad liegen sollte.
A: Wenn es nur einen Hauptpeak zwischen 80 Grad und 90 Grad gibt, bedeutet dies, dass die Echtzeit-PCR perfekt ist.
B: Wenn der Hauptpeak zwischen 80 Grad und 90 Grad erscheint und der Verunreinigungspeak unter 80 Grad erscheint, wird grundsätzlich das Primer-Dimer betrachtet. Dies ist eine gute Möglichkeit, dies durch Erhöhen der Glühtemperatur zu lösen.
C: Wenn der Hauptpeak zwischen 80 Grad und 90 Grad erscheint und ein Wanderpeak erscheint, wenn die Temperatur ansteigt, wird grundsätzlich eine DNA-Kontamination in Betracht gezogen. Und die DNA muss in der Anfangsphase des Experiments entfernt werden.
7. Standardkurvenlinie
Standardstandards wurden auf unterschiedliche Konzentrationen verdünnt und als Matrizen für PCR-Reaktionen verwendet. Die Standardkurve ist mit dem Logarithmus der Standardkopienzahl als Abszisse und dem gemessenen CT-Wert als Ordinate aufgetragen. Bei der Quantifizierung einer unbekannten Probe kann die Kopienzahl der Probe anhand des CT-Werts der unbekannten Probe aus der Standardkurve ermittelt werden. Standardkurven sind sehr wichtig für die absolute Quantifizierung.
der zweite Teil. häufiges Problem
Q1: Was ist der Unterschied zwischen RT-PCR, QPCR, Echtzeit-PCR und Echtzeit-RT-PCR?
A1: RT-PCR ist eine reverse Transkriptions-PCR, die eine weit verbreitete Variante der Polymerase-Kettenreaktion ist. Bei der RT-PCR wird der RNA-Strang revers in komplementäre DNA transkribiert, die dann als Vorlage für die PCR verwendet wird, um die DNA durch PCR zu amplifizieren.
Echtzeit-PCR und QPCR sind dasselbe, beide sind quantitative Echtzeit-PCR, was bedeutet, dass bei jedem Zyklus während des PCR-Prozesses Daten in Echtzeit aufgezeichnet werden. Auf diese Weise lässt sich die Anzahl der Startup-Templates genau analysieren.
Obwohl sowohl die Echtzeit-PCR als auch die Reverse-Transkriptions-PCR als RT-PCR abgekürzt zu sein scheinen, bezieht sich die internationale Konvention darauf, dass sich RT-PCR speziell auf die Reverse-Transkriptions-PCR bezieht, während die Echtzeit-PCR häufig als qPCR (Quantitative Real-PCR) abgekürzt wird. True Real-True Real PCR ) - Zeit-PCR).
Echtzeit-RT-PCR (RT-QPCR) ist eine Art Reverse-Transkriptions-PCR, die fluoreszierende quantitative Techniken kombiniert: zuerst reverse Transkription von RNA, um cDNA (RT) zu erhalten, gefolgt von quantitativer Analyse unter Verwendung von Echtzeit-PCR (QPCR).
F2: Warum wird die Länge des amplifizierten Produktfragments der quantitativen Fluoreszenz-PCR innerhalb des Bereichs von 80-300 bp kontrolliert?
A2: Die Länge jeder Gensequenz ist unterschiedlich, einige von ihnen sind mehrere Kb und Hunderte von BP. Wenn wir jedoch den Primer entwerfen, müssen wir nur verlangen, dass die Länge des Produkts 80-300 bp beträgt, und zu kurz oder zu lang ist für den quantitativen PCR-Nachweis nicht geeignet.
Produktfragmente sind zu kurz, um von Primer-Dimeren unterschieden zu werden. Die Länge des Primer-Dimers beträgt etwa 30-40 bp, bei weniger als 80 bp ist es schwierig zu unterscheiden, ob es sich um ein Primer-Dimer oder ein Produkt handelt. Wenn das Produktfragment zu lang ist und 300 bp überschreitet, führt dies leicht zu einer geringen Amplifikationseffizienz, und die Genmenge kann nicht effektiv nachgewiesen werden.
Wenn Sie beispielsweise die Anzahl der Personen in einem Klassenzimmer zählen, müssen Sie nur zählen, wie viele Münder es gibt. Dasselbe gilt für das Testen von Genen. Sie müssen nur eine bestimmte Sequenz eines Gens nachweisen, um die gesamte Sequenz darzustellen. Es ist leicht, einen Fehler zu machen, wenn Sie sowohl Münder als auch Nasen, Ohren und Brillen zählen, um Menschen zu zählen.
Q3: Was ist die optimale Länge für das Zündhütchendesign?
A3: Im Allgemeinen sind Primerlängen im Bereich von 20-24bp gut. Natürlich müssen wir bei der Auslegung des Primers auf den TM-Wert des Primers achten, da dieser mit der optimalen Glühtemperatur zusammenhängt. Nach vielen Experimenten hat sich herausgestellt, dass 60 Grad ein guter TM-Wert ist. Eine niedrige Annealing-Temperatur kann leicht zu einer unspezifischen Amplifikation führen, während eine hohe Annealing-Temperatur normalerweise zu einer geringen Amplifikationseffizienz, einem späten Peak der Amplifikationskurve und einem verzögerten CT-Wert führt.
Frage 4: Beeinflusst die gesammelte Probenmenge die Versuchsergebnisse?
A4: Nein. Je mehr Proben gesammelt werden, desto mehr RNA wird extrahiert, desto mehr cDNA und desto mehr Zielfragmente werden natürlich vorhanden sein. Für eine absolute Quantifizierung ist es notwendig, die Kopienzahl des Zielfragments zu berechnen, und die Menge der gesammelten Probe beeinflusst definitiv die experimentellen Ergebnisse. Beispielsweise dient der Nachweis des Hepatitis-C-Virus HBV im Blut dazu, den HBV-Gehalt in einer bestimmten Menge (1 ml) Blut nachzuweisen.
Bei der in der wissenschaftlichen Forschung üblichen relativen Quantifizierung hat die Anzahl der Proben nichts mit den experimentellen Ergebnissen zu tun, da sich die relative Quantifizierung auf den Vergleich zwischen Zielgen und Referenzgen bezieht. Betrachten Sie sie einfach als stromaufwärts und stromabwärts gelegene Fragmente, die im selben Nukleinsäurestrang vorhanden sind. Bei einem großen Stichprobenumfang werden Referenz- und Zielgene gleichzeitig zu gleichen Anteilen erhöht, was die Ergebnisse nicht beeinflusst.
F5: Beeinflusst die Effizienz der reversen Transkriptase die experimentellen Ergebnisse?
A5: Wie oben. Beachten Sie, dass wir eine höhere RT-Effizienz wünschen, aber wir bevorzugen, dass das RT-Enzym relativ stabil ist und einheitliche Ergebnisse erzielt. Dies wird ein Test der optimierten Fähigkeiten der Reverse-Transkription-Suiten der großen Unternehmen sein.
Frage 6: Beeinflusst die Effizienz des TAQ-Enzyms die Versuchsergebnisse?
A6: Die Effizienz des TAQ-Enzyms ist relativ groß. Typischerweise sind Hot-Start-Taq-Enzyme erforderlich und relativ effizient. Für kommerzielle Fluoreszenz-Quantifizierungskits optimiert jeder Hersteller die Effizienz des besten Zustands gemäß seinen eigenen Produkten auf nahezu 100 Prozent. Wenn die Effizienz zu niedrig ist, können die experimentellen Ergebnisse nicht erhalten werden. Für die Produkte verschiedener Unternehmen ist dies ein Qualitätsmaßstab.
Frage 7: Beeinflusst die Menge an Fluoreszenzfarbstoff die Versuchsergebnisse?
A7: Ja, das wird es. Wenn das Fluorochrom zu gesättigt ist, kann es bei einigen Instrumenten zu Rauschstörungen kommen. Wenn das Fluorochrom nicht gesättigt und der Fluoreszenzwert zu niedrig ist, tritt es früh in eine Plateauphase ein und die Amplifikationskurve ist flach. Im quantitativen Fluoreszenzexperiment ist hauptsächlich der CT-Wert zu sehen, daher ist es nicht wichtig, dass die späte Amplifikationskurve in das Plateaustadium eintritt, aber das Bild ist nicht schön genug. Wenn Sie sich entscheiden müssen, wählen Sie zunächst ein Fluorochrom, das etwas weniger gesättigt ist. Bei der Verwendung des gleichen Produkts des gleichen Unternehmens ist die Wirkung jedoch im Grunde vernachlässigbar.
Frage 8: Beeinflusst die Übertragung des PCR-Röhrchens die Versuchsergebnisse?
A8: Ja. Für dieselbe Charge von Verbrauchsmaterialien desselben Herstellers kann dieser Effekt jedoch vernachlässigt werden. Dies ist eine gute Wahl und es ist am besten, eine 96-Well-Platte mit einer hochdurchlässigen Membran zu verwenden, um den Effekt der Lichtdurchlässigkeit der Verbrauchsmaterialien zu minimieren.
F9: Beeinflussen Fehler während des Betriebs die Versuchsergebnisse?
A9: Der Einfluss des Betriebsprozesses spiegelt sich hauptsächlich in der Gleichmäßigkeit wider. Homogenität bedeutet, dass alle Komponenten im System gleichmäßig miteinander vermischt sind, und Flash-Zentrifugation kann dieses Problem lösen. Außerdem ist es für Anfänger am besten, das PCR-System auf mehr als 20 Zoll einzustellen, und ein zu kleines System ist anfälliger für Fehler. Wenn die Annealing-Temperatur richtig optimiert wird, wird die Auswirkung der Primerkonzentration auf CT minimiert. Und Sie werden wissen, dass einige Betriebsfehler (z. B. Primerkonzentration) durch Optimieren der Annealingtemperatur vermieden werden können.
Zusammenfassen
Die oben genannten Fragen sind einige Fragen, auf die Anfänger während des Experiments häufig stoßen. Wir hoffen, dass diese Fragen Ihnen helfen können, einige Verwirrung zu lösen. Experimentieren ist der Prozess, Chaos zu erzeugen und Probleme zu lösen, hoffentlich haben Sie etwas davon. Danke fürs Lesen und bis zum nächsten Mal!