PCR-Nachweis
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet ein DNA-Stück als Matrize, und unter Beteiligung von DNA-Polymerase und Nukleotidsubstrat wird die DNA auf eine ausreichende Menge für die Struktur- und Funktionsanalyse amplifiziert. Der PCR-Nachweismethode kommt in der klinischen Schnelldiagnostik bakterieller Infektionskrankheiten eine äußerst wichtige Bedeutung zu.
Das Prinzip der PCR wird verwendet, um ein DNA-Fragment zwischen zwei bekannten Sequenzen zu amplifizieren, ähnlich dem Replikationsprozess natürlicher DNA. Das zu amplifizierende DNA-Molekül wird als Matrize verwendet, und ein Paar von Oligonukleotidfragmenten, die komplementär zum 5'Ende und 3'Ende der Matrize sind, wird als Primer verwendet. Unter Einwirkung der DNA-Polymerase folgt es der Matrize nach dem halb-reservierten Replikationsmechanismus. Kettenverlängerung bis zum Abschluss der neuen DNA-Synthese, diesen Vorgang wiederholen, das Ziel-DNA-Fragment kann amplifiziert werden.
(PCR) ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese spezifischer DNA-Fragmente in vitro. Es besteht aus mehreren Schritten der Hochtemperatur-Denaturierung, Niedertemperatur-Annealing und geeigneter Temperaturverlängerung. Merkmale wie hohe Empfindlichkeit, einfache Bedienung und Zeitersparnis. Es kann nicht nur in der Grundlagenforschung wie Genisolierung, Klonierung und Nukleinsäuresequenzanalyse eingesetzt werden, sondern auch in der Diagnose von Krankheiten oder überall dort, wo DNA und RNA vorhanden sind. Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, kurz PCR) wird auch als zellfreie molekulare Klonierung oder spezifische DNA-Sequenz-in-vitro-Primer-gerichtete enzymatische Amplifikationstechnologie bezeichnet.
Die semi-reservierte Replikation von DNA ist ein wichtiger Weg für die biologische Evolution und Passage. Doppelsträngige DNA kann unter Einwirkung verschiedener Enzyme denaturiert und zu einem Einzelstrang verschmolzen werden. Unter Beteiligung von DNA-Polymerase und einem Promotor kann die doppelsträngige DNA nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung in die gleichen zwei Moleküle repliziert werden. In Experimenten wurde festgestellt, dass DNA auch bei hohen Temperaturen denaturiert und geschmolzen werden kann und bei niedrigerer Temperatur wieder in Doppelstränge renaturiert werden kann. Daher kann durch die Kontrolle der Denaturierung und Renaturierung von DNA durch Temperaturänderungen und das Entwerfen von Primern als Promotoren die Zugabe von DNA-Polymerase und dNTPs die in vitro-Replikation spezifischer Gene vervollständigen.
Der einfache Punkt besteht darin, eine spezielle Ausrüstung zu verwenden, dNTPS, Mg2+, spezifische Primer, DNA-Polymerase und ein Puffersystem zu verwenden, eine Matrize, die die DNA-Probe für die in vitro-Amplifikation ist, hinzuzufügen und eine Elektrophorese durchzuführen. Wenn es amplifiziert werden kann und die Größe des amplifizierten Produkts mit der Zielbande übereinstimmt, bedeutet dies, dass Primer und Matrize spezifisch sind und der Nachweisindex positiv ist.
PCR-Nukleinsäurenachweismethoden und -schritte
Nukleinsäuretests erfordern fünf Schritte: Probenahme, Probenaufbewahrung, Aufbewahrung, Nukleinsäureextraktion und Computertests.
Nukleinsäurenachweis
Der erste Schritt besteht darin, menschliche Sekrete zu sammeln und die Nasenhöhle oder Rückwand des Rachens und die beidseitigen Rachenmandeln mit einem Nasentest oder einem Rachentest abzuwischen.
Im zweiten Schritt behielt das medizinische Personal die Probe, tauchte den Probenkopf in die Zellkonservierungslösung und schraubte die Röhrchenkappe sofort nach dem Abbrechen des Schwanzes auf.
Legen Sie im dritten Teil die Probe in einen luftdichten Beutel, bewahren Sie sie auf und senden Sie sie rechtzeitig zur Überprüfung.
Der vierte Schritt besteht darin, die Probe an das Labor zu schicken, um Nukleinsäure zu extrahieren.
Im fünften Schritt wird der Extrakt einer Fluoreszenz-PCR-Amplifikationsreaktion unterzogen.
Benötigen Sie auch einige Verbrauchsmaterialien und Instrumente
PCR-Instrument, PCR-Röhrchen, Pipettenspitze, Deep-Well-Platte, Reservoir und Reagenzien hinzugefügt