Die PCR-Technologie muss vernünftige Primer und extrahierte Proben-DNA künstlich synthetisiert haben und dann automatische thermische Zyklen durchführen und schließlich Produktidentifikation und -analyse durchführen. Das Design und die Synthese von Primern können derzeit nur in wenigen Forschungsinstituten, Instituten und Kliniken mit starker technischer Stärke durchgeführt werden. Die Anwendung muss nur das PCR-Nachweiskit kaufen, um mit der Arbeit zu beginnen. Es gibt viele Einflussfaktoren im automatischen PCR-Thermozyklus. Bei verschiedenen DNA-Proben sind die Menge der verschiedenen Komponenten, die in der PCR-Reaktion hinzugefügt werden, und die Parameter des Temperaturzyklus uneinheitlich.
Einige Haupteinflussfaktoren werden nun wie folgt eingeführt.
Eins, Temperaturzyklusparameter
Beim automatischen Thermozyklus der PCR ist die Temperatur der Denaturierung und des Annealings der kritischste Faktor. Wie im Arbeitsbeispiel gezeigt, sind die Bedingungen für Denaturierung, Annealing und Extension: 94–60s, 37–60s, 72–120s, insgesamt 25–30 A Zyklus, das amplifizierte Fragment ist 500 bp lang. Hier sollte die Zeit jedes Schrittes berechnet werden, nachdem die Reaktionsmischung die erforderliche Temperatur erreicht hat. Im automatischen Thermocycler dauert die Zeit von der ursprünglichen Temperatur der Mischung bis zur erforderlichen Temperatur 30-60 s Die Länge dieser Verzögerungszeit hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Art des Reaktionsrohrs, der Wandstärke, des Volumens der Reaktionsmischung, Quelle (Wasserbad oder Heizblock) und die Temperaturdifferenz zwischen den beiden Schritten, die bei der Einstellung des Temperaturzyklus angemessen berücksichtigt werden sollte.
Eine weitere wichtige Überlegung bezüglich der thermischen Zykluszeit ist der Abstand zwischen den beiden Primern; je weiter der Abstand, desto länger dauert es, die volle Länge der Zielsequenz zu synthetisieren. Die oben angegebene Reaktionszeit bezieht sich auf die optimale Syntheselänge von 500bp. Die Zielsequenz wird erstellt. Hier eine Einführung in die Auswahl verschiedener Temperaturen.
1. Template-Denaturierungstemperatur Die Denaturierungstemperatur bestimmt die Temperatur, bei der die doppelsträngige DNA in der PCR-Reaktion schmilzt. Wird die Denaturierungstemperatur nicht erreicht, wird keine einzelsträngige DNA-Matrize produziert und die PCR wird nicht gestartet. Niedrige Denaturierungstemperatur bedeutet unvollständige Denaturierung, DNA doppelsträngig Sie renaturiert schnell, wodurch die Ausbeute reduziert wird. Im Allgemeinen 90～95℃. Sobald die Probe diese Temperatur erreicht hat, sollte sie schnell auf die Glühtemperatur abgekühlt werden. Die DNA-Denaturierung dauert nur wenige Sekunden und ist für lange Zeit nicht notwendig; im Gegenteil, Sie sollten Ihr Bestes bei hohen Temperaturen geben. Kürzen Sie es, um die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase zu erhalten. Die maximale Denaturierungstemperatur nach Zugabe von Taq DNA Polymerase sollte 95 °C nicht überschreiten.
2. Primer-Annealing-Temperatur Die Annealing-Temperatur bestimmt die Spezifität und Ausbeute der PCR; wenn die Temperatur hoch ist, ist die Spezifität stark, aber wenn die Temperatur zu hoch ist, kann der Primer nicht fest mit der Matrize kombiniert werden und die DNA-Amplifikationseffizienz wird verringert; die Temperatur ist niedrig, die Ausbeute ist hoch, aber zu niedrig kann zu einer Fehlpaarung von Primer und Templat führen. Unspezifische Produkte nehmen zu. Beginnen Sie im Allgemeinen mit der Reaktionsbedingung von 37 ° C und richten Sie eine Reihe von Kontrollreaktionen ein, um die optimale Annealing-Temperatur für eine bestimmte Reaktion zu bestimmen. Es kann auch anhand des (G+C)%-Gehalts der Primer geschlossen werden, um den Test zu erfassen Der Ausgangspunkt des allgemeinen Tests, die Annealing-Temperatur Ta (Annealing-Temperatur) ist 5℃ niedriger als die Schmelztemperatur TTm (Schmelztemperatur) des Amplifikationsprimers, die nach folgender Formel berechnet werden kann:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Von diesen repräsentieren A, T, G bzw. C die Anzahl der entsprechenden Basen. Beispielsweise kann für einen Primer von 20 Basen, wenn der Gehalt an (G+C)% 50% beträgt, der Startpunkt von Ta auf 55°C eingestellt werden. Bei einer typischen Primerkonzentration (z. B. 0,2 μmol/L) kann die Annealing-Reaktion in wenigen Sekunden abgeschlossen werden, und ein langfristiges Annealing ist nicht erforderlich.
3. Die Wahl der Primer-Extension-Temperatur hängt von der optimalen Temperatur der Taq-DNA-Polymerase ab. Im Allgemeinen 70～75℃ kann die Standardrate von enzymkatalysierten Nukleotiden bei 72℃ 35～100 Nukleotide/s erreichen. pro Minute. Die Länge von 1 kb kann verlängert werden, und ihre Geschwindigkeit hängt von der Zusammensetzung der Pufferlösung, dem pH-Wert, der Salzkonzentration und der Art der DNA-Matrize ab. Wenn das amplifizierte Fragment kürzer als 150 bp ist, kann der Verlängerungsschritt weggelassen werden, und es wird aufgrund der Taq-DNA ein dualer Temperaturzyklus. Die Polymerase reicht aus, um die Synthese kurzer Sequenzen bei der Annealing-Temperatur zu vervollständigen. Für kurze Sequenzfragmente zwischen 100 und 300 bp ist es effektiv, einen schnellen und einfachen Zweitemperaturzyklus zu verwenden. Zu diesem Zeitpunkt ist die Primer-Extension-Temperatur die gleiche wie die Annealing-Temperatur. Für DNA-Fragmente über 1 kb kann die Verlängerungszeit je nach Länge des Fragments innerhalb von 1 bis 7 Minuten kontrolliert werden. Gleichzeitig sollte dem PCR-Puffer Gelatine oder BSA-Reagenz zugesetzt werden, um die Taq-DNA-Polymerase lange aktiv und stabil zu halten. Sex; 15%-20% Glycerin hilft, etwa 2,5 kb oder längere DNA-Fragmente zu amplifizieren.
4. Die Anzahl der Zyklen der herkömmlichen PCR beträgt im Allgemeinen 25 bis 40 Zyklen. Der allgemeine Fehler besteht darin, dass die Anzahl der Zyklen zu hoch ist, der unspezifische Hintergrund gravierend ist und die Komplexität zunimmt. Natürlich ist die Zahl der Reaktionszyklen zu gering und die Ausbeute gering. Daher muss sichergestellt werden, dass das Produkt erhalten wird. Unter der Prämisse der Rate sollte die Anzahl der Zyklen minimiert werden.
Nach Abschluss der Amplifikation wird die Probe abgekühlt und bei 4 °C gelagert.
2. Primer Primer-Design
Um Template-DNA zu amplifizieren, müssen Sie zunächst zwei Oligonukleotid-Primer entwerfen. Die sogenannten Primer sind eigentlich zwei Oligonukleotidfragmente, die komplementär zur zu amplifizierenden Ziel-DNA-Sequenz sind. Der Abstand zwischen den beiden Primern bestimmt die Länge des amplifizierten Fragments. , Die 5'Enden der beiden Primer bestimmen die Positionen der beiden 5'Enden des amplifizierten Produkts. Es ist ersichtlich, dass die Primer der Schlüssel zur Bestimmung der Länge, Position und Ergebnisse der PCR-amplifizierten Fragmente sind und das Primerdesign wichtiger ist.
Die notwendige Bedingung für das Primerdesign ist, dass die zum Primer komplementäre Ziel-DNA-Sequenz bekannt sein muss. Die Sequenz zwischen den beiden Primern ist nicht unbedingt klar. Die beiden bekannten Sequenzen haben im Allgemeinen 15-20 Basen, die mit einem DNA-Synthesizer synthetisiert werden können. Entsprechend zwei komplementären Primern umfassen die im Allgemeinen beim Primerdesign befolgten Prinzipien:
1. Die Primerlänge wird statistisch berechnet, und die Wahrscheinlichkeit, dass eine Oligonukleotidsequenz von etwa 17 Basen im menschlichen Genom vorkommen kann, beträgt einmal. Daher beträgt die Primerlänge im Allgemeinen nicht weniger als 16 Nukleotide und die höchste Länge nicht mehr als 30 Nukleotide, und die beste Länge beträgt 20–24 Nukleotide. Solche kurzen Oligonukleotide bilden bei der Polymerisationstemperatur (über 72°C) kein stabiles Hybrid. Manchmal kann es bei 5' sein; Fügen Sie am Ende Sequenzen hinzu, die nicht komplementär zur Matrize sind, wie z. B. Restriktionsenzymstellen oder Promotoren, um die Genklonierung und andere spezielle Anforderungen zu vervollständigen; der Primer 5'End-Biotin-Marker oder Fluoreszenz-Marker kann für verschiedene Zwecke, wie zum Beispiel den mikrobiellen Nachweis, verwendet werden.
Manchmal funktioniert die Grundierung'nicht, der Grund ist unbekannt, Sie können die Position verschieben, um das Problem zu lösen.
2. Die Zusammensetzung der Grundierungen mit (G+C)%-Gehalt sollte einheitlich sein und versuchen, das gleiche Basispolymer zu vermeiden. Der (G+C)%-Gehalt in den beiden Primern sollte so ähnlich wie möglich sein, im bekannten amplifizierten Fragment (G+C) sollte der %-Gehalt im Allgemeinen nahe dem zu amplifizierenden Fragment liegen 40% bis 60% sind besser.
3. Die Innenseite des Primers sollte die Bildung von offensichtlichen Sekundärstrukturen, insbesondere Haarnadelstrukturen, vermeiden. Zum Beispiel:
4. Es sollte keine Komplementation zwischen den beiden Primern zwischen den Primern vorliegen, insbesondere am 3'Ende des Primers. Auch wenn es nicht vermieden werden kann, sollte die komplementäre Base am 3'Ende nicht größer als 2 Basen sein, sonst ist es leicht, ein"Primerdimer" zu bilden; Oder"Primerdimer" (Primerdimer). Das sogenannte Primerdimer ist im Wesentlichen ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das durch Verlängerung eines Primers auf die andere Primersequenz unter Einwirkung von DNA-Polymerase gebildet wird. , Ist ein häufiges Nebenprodukt der PCR und wird manchmal sogar zum Hauptprodukt.
Vermeiden Sie außerdem homologe Sequenzen zwischen den beiden Primern, insbesondere Oligonukleotidfragmente mit mehr als 6 aufeinanderfolgenden identischen Basen, da sonst die beiden Primer miteinander um dieselbe Stelle der Matrize konkurrieren; ebenso dürfen die Primer und die zu amplifizierende Ziel-DNA oder andere Sequenzen der Proben-DNA keine homologen Sequenzen von mehr als 6 Basen aufweisen. Andernfalls binden die Primer an andere Stellen, wodurch die spezifische Amplifikation reduziert und die unspezifische Amplifikation erhöht wird.
5. Primer 3'Endpaarungs-DNA-Polymerase fügt ein einzelnes Nukleotid an das 3'Ende des Primers hinzu. Daher müssen die Paarungsanforderungen von 5-6 Basen vom 3'Ende des Primers und der Ziel-DNA präzise und streng sein, um eine effektive PCR-Amplifikation zu gewährleisten. .
Ob das Primerdesign sinnvoll ist, kann durch Computersuche unter Verwendung der PCRDESN-Software und der American PRIMER-Software überprüft werden.
Künstlich synthetisierte Oligonukleotide sollten vorzugsweise durch Chromatographie (Chromatographie) oder PAGE gereinigt werden, um Verunreinigungen wie kurze Ketten zu entfernen, die nicht in voller Länge synthetisiert wurden. Gereinigte Primer, die in einer 25%igen Acetonitril-Lösung bei 4 °C gelagert werden, können Mikroorganismen vorbeugen Unter normalen Umständen sollten nicht verwendete Primer im Kühlschrank bei -20 °C gelagert werden. Die Primer sind 6 Monate in Flüssigkeit und 1 bis 2 Jahre nach der Lyophilisierung lagerfähig.